بایو موادشبکه تبادل محصولات، خدمات و اطلاعات زیستی
  •   یکشنبه ۲۵ آذر ۱۳۹۷
بایو مواد

آخرین اخبار

آخرین همایش ها

روشهای مختلفی برای تخلیص DNA   وجود دارد که در اینجا به چند روش برای تخلیص DNA   از خون و نمونه های بافتی می پردازیم .
 

1 – تخلیص DNA   از خون :

بــرای تخلیـص DNA   از گلبولهای سفید خون استفاده می شود . برای این کار چندین روش از جمله روش فنل – کلروفرم ، روش پروتئیناز K  ، روش جوشاندن ، روش اسید – گوانیدیوم – فنل – کلروفرم ( AGPC ) و … استفاده می شود که در اینجا دو روش پروتئیناز K  و روش جوشاندن به علت کم هزینه بودن آنها شرح داده می شود .
 

( 1 – 1 ) روش جوشاندن :

مواد مورد نیاز :

1 – بافر لیز کننده گلبولهای قرمز ( بافر R ) : که شامل مواد زیر می باشد :

- باز تریس                  با PH = 7/5           10 میلی مولار

- ساکارز                                              32%  مولار

- کلرید منیزیم ( MgCl 2  )        10 میلی مولار یا 5 میلی مولار

- تریتون 100X                                          1%

مخلوط کرده و حجم را با آب مقطر به 50 میلی لیتر می رسانیم .

2 – محلول ( I ) : هیدروکسید سدیم ( NaOH  ) 50 میلی مولار

3 – محلول ( II  ) . باز تریس             یک مولار

روش کار:

نیـم میلی لیتر خون فاقد هپارین را در میکروتیوب ریخته و به آن یک میلی لیتر بافر R اضافه می کنیم و خوب مخلوط می کنیم . سپس به مدت دو دقیقه با شدت 1000 دور در دقیقه آنرا سانتریفوژ می کنیم . بعد محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیزشده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً حدود 200 میکرو لیتر بافر R به میکروتیوب اضافه کرده و هم می زنیم تا رسوب موجود در میکروتیوب به رنگ سفید در آید و مجدداً با شدت1000دور در دقیقه سانتریفوژ می کنیم . این عمل را تا تهیه رسوب کاملاً سفید ادامه می دهیم . در مرحله بعد 100 میکرولیتر محلول(I) بر روی رسوب ریخته و آنقدر هم می زنیم تا رسوب حل شود . سپس میکرو تیوبها را به مدت 20 دقیقــه در آب جــوش قــرار داده تا گلبولهای سفید لیز شوند . در آخرین مرحله 20 میکـرولـیتر محـلول (II) را بـه میکروتیوپ اضافه می کنیــم . ( ایــن محلول باعث نگهداری و حفاظت DNA در محلول می شود) و هم می زنیم و سپس به مدت 30-20 ثانیه با دور 1000 سانتریفوژ می کنیم و در نهایت محلول رویی که حاوی DNA می باشد با احتیاط به یک میکروتیوپ جدید منتقل می کنیم . سپس با اتانل مطلق DNA  را رسوب می دهیم.

بحث :

روش جوشاندن دارای معایب و محاسن متعددی است . این روش اصولاً دارای مرحله ای تحت عنوان خالص سازی نمی باشد ، بلکه توانایی آن تنها از این نظر مهم میباشد که میتواند DNA  را در دسترس قرار دهد . علاوه بر این مواد مصرفی در این روش کمتر بوده و در زمان کوتاه امکان کار با نمونه های انبوه وجود داشته و آلودگی در آزمایشگاه نیز کمتر خواهد بود . از معایب این روش هم عدم حذف کامل مهار کننده ها می باشد و دیگر اینکه روش جوشاندن قادر به استفاده نمونه های با مقادیر کم DNA  نمی باشد . با وجود معایب متعدد آن بواسطه سرعت مطلوب این روش در بسیاری از آزمایشگاههای تشخیص طبی که از PCR  استفاده می گردد برای آماده نمودن  DNA از آن استفاده می نمایند( 7 ) .  با استفاده ازاین روش می توان به آسانی از خون تازه ، لخته شده ، کهنه و خشک و همچنین عوامل بیماریزا  DNA را استخراج کرد.
 

( 2 – 1 ) روش پروتئیناز K :

مواد مورد نیاز :

1 – بافر لیزکننده گلبولهای قرمز ( بافر R )

2 – بافرP  که شامل مواد زیر می باشد :

- اتیلن دی آمین تترااستیک اسید ( EDTA )   با 2/8 = PH  2 میلی مولار

- باز تریس         10 میلی مولار

- کلرید سدیم ( NaCl  )      44% مولار

3 – محلول S  : سدیم دودسیل سولفات ( SDS )   10%

4 – محلول N  : کلرید سدیم ( NaCl  )     4 مولار

5 – محلول TE  که شامل مواد زیر می باشد :

- EDTA  با    8 = PH           1 میلی مولار

- باز تریس با     6/7 = PH          10 میلی مولار

6 – پروتئیناز K   : از این آنزیم با غلظت 20 میلی گرم در میلی لیتر ( mg/ml  20 ) استفاده می شود که پروتئینهای هیستونی و غیر هیستونی در DNA   را تخریب می کند . این آنزیم در دمای 55 درجه سانتی گراد بهترین فعالیت را دارا می باشد .

7 – اتانل مطلق و اتانل 70 درصد

روش کار :

نیــم میلی لیتر خون را در یک میکروتیوب ریخته و برای لیز کردن گلبولهای قرمز به آن به میزان یک میلی لیتر بافر R  اضافه می کنیم خوب مخلوط کرده و با دور xg 1000  به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ انجام می گردد . پس از سانتریفوژ ، محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیز شده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً حدود 500-200 میکرولیتر بافر R  به میکروتیوب اضافه می کنیم و بعد سانتریفوژ انجام می گیرد . این کار را تا به دست آوردن رسوب سفیــد رنگ در میکروتیــوب ادامــه می دهیــم . پس از تهیه رسوب سفید ، 300 میکرولیتر بافر P  به منظور لیز کردن گلبــولهای سفید به مبکروتیوب اضافه می کنیم و پس از هم زدن ، به میزان 20 میکرولیتر محلول S  ( جهت دناتوره کردن پروتئینها ) به میکروتیوب اضافه می کنیم و آنقدر هم می زنیم تا رسوب کاملاً حل گردد . بعد به میزان 5 میکرولیتر از آنزیم پروتئیناز K ( mg/ml  20 ) به میکروتیوب اضافه کرده و خوب حل می کنیم . سپس میکروتیوبها در دمای 55 درجه سانتی گراد و به مدت یک ساعت انکوبه می شوند ( در طول شب در دمای 37 درجه نیز قرار داده می شود . ) بایستی هر 5 دقیقه یکبار محتویات میکروتیوب را هم زد . پس از گذشت این زمان ، صد میکرولیتر محلول   N  به لوله اضافه شده و به طور مختصر هم می زنیم و بعد به مدت 30 – 10 دقیقه در یخ قرار داده تا حالت ابری ( به علت رسوب پروتئینها ) در محلول داخل میکروتیوب مشاهده شود . میکروتیوب را به مدت 10 دقیقه با دور xg  1000 سانتریفوژ می کنیم و محلول شفاف رویی با احتیاط به میکروتیوبهای جدید منتقل می شود . ( رسوب موجود حاوی پروتئینهای دناتوره می باشد . ) به محلول رویی جدا شده یک میلی لیتر اتانول مطلق سرد اضــافه شــده و بــه آرامــی هــم می زنیم . تا کلافهای شیری رنگ DNA  مشاهده شود . سپس مدت 10 دقیقه با دور xg  1000  سانتریفوژ نموده و محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب ( مولکولهای DNA  ) باقی مانده صد میکرولیتر اتانل 70 درصد ریخته ( جهت شستشو ) و خوب هم می زنیم و سپس برای مدت 2 دقیقه با دور xg  1000 سانتریفوژ می کنیم . محلول رویی را دور ریخته و میکروتیوبها را به کمک حرارت در زیر هود و درجه حرارت اتانل خشک می کنیم و سپس به هر یک از میکروتیوبها 100 میکرولیتر بافر TE  یا آب مقطر بدون یون اضافه کرده و به آرامی به هم زده تا رسوب DNA  حل شود . برای حل شدن بهتر DNA  می تونا از حرارت 60 درجه ســـانتی گراد حمام بخار آب جوش استفاده می شود.
 

2 – تخلیص DNA  از نمونه بافتی ( کرم ، اسکولکس ، جفت و … ) :

روشهای مختلفی از قبیل آنزیم تریپین ، روش جوشاندن ، روش اسید گوانیدیم فنل کلروفرم ( AGPC ) ، روش  IRIzol  وجود دارد که در اینجا به شرح چند روش می پردازیم :
روش ایرایزول IRIzol روشی بسیار بدیع و کاملا ایرانی است که محصول شرکت زیست فناوران رنا است. این کیت یک مرحله ای بوده و بر روی تمام وجودات زنده و مرده منجر به استخراج DNA  شده است.

جدیدترین محصولات و خدمات بازار

فعال ترین کاربران بازار بایو مواد

امیررضا ضیائیتعداد 20 محصول/خدمت  

فاطمه کامرانتعداد 15 محصول/خدمت  

ستاره سهیلتعداد 15 محصول/خدمت  

سبد خرید و فروش محصولات و خدمات

سبد خرید و فروش محصولات و خدمات

Item removed. Undo